***2
کاربرد اسپکترو فتو متری در بیو شیمی
اسپکتروفتومتری
بوسیله اسپکتروفتومتر شدت رنگ محلولها را با دقت اندازه گیری می کنند.
دستگاههائی که برای رنگ سنجی به کار برده می شوند الکتروفتومترو یا اسپکتروفتومتر نامیده می شوند.
شمای ساده زیر قسمتهای مختلف یک الکتروفتومتر را نشان می دهد.
***3
بطور کلی هر اسپکتروفتومتر:
• یک منبع نورانی،
•یک وسیله ایجاد نور تکرنگ با طول موج مشخص
• یک سلول یا لوله مخصوص برای جادادن محلول رنگی
•، یک سلول فتوالکتریک و یک گالوانومتر دارد.
***4
به دو روش می توان غلظت یک محلول را اندازه گیری کرد:
الف) از راه اندازه گیری نوری که از محلول رنگی خارج می شود و
به آن ،Transmitance ،یا عبور می گویند؛
ب) اندازه گیری مقدار نوری که جذب محلول رنگی می شود و به آن دانسیته اپتیک (OPTICAL DENSITY) O.D یا آبسوربنس می گویند.
***5
الف) دانسیته اپتیک یا آبسوربنس
نوری که از یک محلول رنگی عبور می کند مقداری از آن جذب محلول رنگی می شود .
اگر Io شدت نور اولیه و I شدت نور خارج شده از محلول باشد بنابراین I a شدت نوری است که جذب محلول رنگی گردیده است.
Ia = I - Io
Log Io - log I =OD = Absorbanc
logI/I0=OD
(1) log I0/I=OD
***6
جذب از دو قانون پیروی می کند:
مطابق قانون بیرولامبرت (BEER & LAMBERT) هنگامیکه نور یک رنگ از محلول رنگی عبور میکند مقدار نوری که به وسیله محلول جذب می شود ویا مقدار نوری که از محلول خارج می شود؛
به غلظت ماده رنگی موجود در محلول
به ضخامت لوله ایکه نور از آن عبور کرده بستگی دارد گردد.یعنی:
OD=KCL = جذ ب
***7
logIo/I= KCL
که در آن K ضریب جذب ماده مورد آزمایش، C غلظت جسم مورد آزمایش و L قطر لوله می باشد و چون معمولاً قطر لوله را مساوی یک سانتی متر اختیار میکنند بنابراین خواهیم داشت: OD= log I0/I=KC
K یا ضریب جذب ماده برای مواد مختلف فرق می کند و به آسانی قابل اندازه گیری است.
***8
ب) ترانسمیتانس ) عبور) :
مقدار نوری است که از محلول رنگی مورد آزمایش خارج می شود،
اگر شدت نور اولی I0 و نور خارج شده I باشد:
I0-I=Ia
I/I0=T Log I0/I=Log1/T OD=Log1/T
***10
روی صفحه مدرج دستگاه در قسمت بالا درصد نور عبور کرده یا ترانسمیتانس
در قسمت پائین درست در مقابل درجات ترانسمیتانس OD،یا ابز ربنس قرار می هند.
، درجات میزان عبور همه با هم مساوی است.
درجات O D به علت لگاریتمی بودن نامساوی هستند.
***12
انتخاب طول موج مناسب جهت اندازه گیری جذب
نمودار جذب برحسب طول موج را رسم می کنیم.
طول موج منا سب ،طول موجی است که ماکز یمم جذب را دارد.
***13
آزمایش 2 – جهت رسم منحنی دانسیته اپتیک بر حسب غلظت های مختلف:
6 لوله آزمایش انتخاب کرده آن ها را از 1 تا 6 شماره گذاری کنید
به ترتیب در آنها 0 ؛1، 2، 4، 6 و 8 میلی لیتر محلول بروموفنل( mg/L10 ) بریزید.
سپس به ترتیب 10 ، 9 ،8 ، 6 ،4 و2 میلی لیتر آب مقطر بریزید.